Orto-nitrofenylgalaktosidtest på bakterier för att finna sin förmåga att hydrolysera orto-nitrofenyl-PD-galaktosid

Läs den här artikeln för att lära dig om resultatet av Ortho-Nitrophenyl Galactoside Test på Bakterier för att finna sin förmåga att hydrolysera orto-nitrofenyl-PD-galaktosid!

Princip:

Vissa bakterier har förmåga att fermentera laktos. De kallas "laktosgerande bakterier" eller "laktosfomenters".

De andra, som inte kan fermentera laktos, kallas laktosfria fermenterande bakterier "eller" laktos-icke-fomenters ".

De laktosgerande bakterierna kan producera två enzymer, nämligen "permeas" och "P-galaktosidas", vilka är involverade i fermentering av laktos. Permease hjälper till vid införandet av laktos i bakteriecellerna, medan β-galaktosidas hydrolyserar laktos till glukos och galaktos, är β-galaktosidas ett intracellulärt inducerbart enzym, vars produktion induceras av närvaron av laktos i bakteriecellernas miljö.

Medan laktosgerande bakterier kan producera såväl permeas som β-galaktosidas kan laktos-icke-fermenterande bakterier inte producera permeas, men kan eller kan inte producera β-galaktosidas. ONPG-testet utförs för att ta reda på förmågan hos laktos-icke-fermenterande bakterier att producera P-galaktosidas.

För detta löses cellmembranet i de laktos-icke-fermenterande bakteriecellerna genom tillsats av toluen för att frigöra alla de intracellulära enzymerna inklusive P-galaktosidas, om sådana finns. Enzymet, p-galaktosidas, hydrolyserar substratet orto-nitrofenyl-P-D-galctosid (ONPG) till orto-nitrofenol, vilket är gult i färg.

I orto-nitrofenylgalaktosidtestet (ONPG-testet) odlas testbakterierna på tripplar av sockerjärnsagar (TSI agar), vilka innehåller laktos. Om bakterierna är en laktos-icke-fermenterad, såsom indikeras av röd rumpa och röd snedställning, tillverkas en tjock suspension av bakterierna i saltlösning, till vilken tillsätts toluen följt av ONPG-lösning. Om bakterierna har förmågan att producera enzymet P-galaktosidas, ändras bakteriens suspension till gul.

Material som krävs:

Provrör, konisk kolv, bomullsproppar, inokuleringsslinga, inokuleringsnål, autoklav, bunsenbrännare, laminärflödeskammare, kassera burk, inkubator, TSI-agar, toluen, o-nitrofenyl-p-D-galaktosidlösning (ONPG), isolerade kolonier eller rena kulturer av bakterier.

Procedur:

1. Ingredienserna i TSI-agarmedium (innehållande 3 sockerarter och järn som huvudkomponenter) eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk flaska genom skakar och virvlar (Figur 7.16).

2. pH-värdet bestäms med pH-papper eller pH-mätare och justeras till 7.4 med 0, 1 N HCI om det är mer eller använder 0, 1N NaOH om det är mindre.

3. Kolven upphettas för att upplösa agar i mediet fullständigt.

4. Innan det stelnar, fördelas mediet i varmt smält tillstånd i 5 provrör (ca 20 ml vardera).

5. Provrören är bomullspluggade, täckta med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

6. De steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter i en autoklav.

7. Efter sterilisering avlägsnas de från autoklaven och hålles i ett lutande läge för att kyla och stelna mediet för att få TSI-agarskenor.

8. Testbakterierna inokuleras aseptiskt, företrädesvis i en laminärflödeskammare, in i skenorna genom att sticka in i rumpan och strimma på ytan av skenorna med hjälp av en flamsteriliserad nål. Nålen steriliseras efter varje ympning.

9. De inokulerade skenorna inkuberas vid 37 ° C i 24 timmar i en inkubator.

10. Om bakterien är en laktos-fermenter, är den inte vald för ONPG-test. Om bakterierna är laktos-icke-fermentor, som indikeras av rödstöt och röd snedställd, väljs den för ONPG-test.

11. Till ett provrör innehållande 0, 25 ml saltlösning sätts en tjock odling av bakterierna medelst en flamsteriliserad slinga för att göra en tjock suspension av bakterierna.

12. En droppe toluen tillsättes, blandas och inkuberas i 5 minuter vid 37 ° C.

13. O-nitrofenylgalaktosidlösning (ONPG-lösning) tillsättes och inkuberas vid 37 ° C under 30 minuter. Därefter observeras färgförändringen. Återigen observeras färgförändring efter 24 timmar.