Topp 3 sekventiella steg för polymeraserkedjereaktion (PCR)

Följande punkter lyfter fram de tre tre sekventiella stegen i polymeras kedjereaktion (PCR). De sekventiella stegen är: Denaturering 2. Annealing 3. Förlängning av DNA.

Sekventiellt steg # 1. Denaturering:

Det första steget är att denaturera DNA (både Primer DNA och Native DNA). Separering av två DNA-strängar är känd som denaturering medan två stånd ihop kallas som omhärdning eller hybridisering (fig 48.1). Upptäckten av denaturering och återanvändning av DNA gjordes konstgjort av Marmor och Lane (1960).

Enligt dem kan det dubbelsträngade DNA separeras i två separata enda strängar (denaturering) genom uppvärmning vid en hög temperatur (90-95 ° C) och hybridisering eller sammanfogning av två DNA-strängar (dubbelsträngat DNA) vilket är möjligt genom minskar temperaturen (50-56 ° C).

Detta är huvudprincipen för vilken PCR fungerar. Den andra principen är förlängning av primern med hjälp av DNA-polymerasenzym.

Det native DNA-, primer- och DNA-polymerasenzymet (Tag-polymeras) tillsätts i ett PCR-rör och temperaturen höjs och sänks i PCR-maskinen för att denaturera och hybridisera.

Sekventiellt steg # 2. Annealing:

Efter detaturering av DNA: n, är nästa steg att låta syntesen av primer vara anneal mot de motsatta DNA-strängarna i den önskade målsekvensen. Annealing (hybridisering) kan uppstå om temperaturen från 95 ° C sänks till 50/56 ° C. Temperaturen sätts sedan ner i maskinen.

Så snart temperaturen sänks kommer de naturliga DNA-strängarna att binda inte bara varandra utan också binda primerna. Denna specifika hybridisering, eller "rekombination" av komplementära nukleotider, ger både rationale och den praktiska grunden för mycket av rekombinant DNA (fig 48.2).

Sekventiellt steg # 3. Förlängning av DNA (Taq-polymerasenzym behövs):

Efter att primerna har glödgats bör de förlängas med användning av oligonukleotidprimeren som startpunkten. beskrivet att enzym-DNA-polymeras är nödvändigt för syntes av DNA. Därför behöver vi, för förlängning av primer, ett termostabil DNA-polymeras så att enzymet inte förstörs vid hög temperatur.

Det termostabila polymeraset (Taq-polymeras) isoleras från Thermus aquaticus. Taq-polymeraset har en enorm fördel vid utförande av PCR-reaktionen. Den har en optimal aktivitetstemperatur på ca 70 ° C och friskt enzym får inte sättas till varje provrör efter uppvärmnings- och kylprocessen.

Termostabil DNA-polymeras tillverkas nu av olika företag med olika källor (andra än Thermus aquaticus) under olika handelsnamn (TM). För utvidgningen av primer tillsätts det termostabila DNA-polymeras i röret och temperaturen höjs sedan till 65-70 ° C.

Efterföljande cykler av strängseparation (denaturering), primerhybridisering (glödgning) och strängsyntes (förlängning) säkerställer exponentiell amplifiering av målsekvenserna genom att använda den amplifierade sekvensen om den föregående cykeln som en ny mall, det finns tre cykler (fig 48.2 ).

Primertillverkning:

Primerna är korta sekvenser (ofta RNA) används för att göra två nukleotider, refererade till primer, med en för varje ände av DNA-fragmentet och ger en fri 3-OH-ände vid vilken ett DNA-polymeras börjar syntes av en deoxiribonukleotidkedja.

En sekvens är gjord i senseriktningen, medan den andra är gjord i antisensriktningen. (Fig 48.2). Primern används för att primpa syntesen av komplementära DNA-strängar och utformas så att DNA mellan primerna är det intressanta fragmentet att amplifieras.

Om messenger-RNA (mRNA) amplifieras måste den omvandlas till gratis DNA (cDNA) med ett RNA-beroende DNA-polymeras, omvänd transkriptas. CDNA-komplexet ändras därefter till dubbelsträngat DNA, varvid det blir mall för en efterföljande PCR-reaktion.

Detta är ofta känt som reverserad transkriptaspolymeraskedjereaktion (RT PCR). Primerna kan genereras artificiellt eller kan köpas från företagen.

Efter att reaktionen är avslutad kan de amplifierade produkterna (DNA) visualiseras genom gelelektrofores. Den viktiga fysikaliska egenskapen hos DNA-molekylen är att varje individuell nukleotid har en netto negativ laddning som härrör från fosfatgruppen.

Således tenderar fragment av olika storlek som exponeras för ett elektriskt fält att migrera mot den positiva elektroden i olika takt beroende på storleken, med små fragment som migrerar snabbare än den större. Denna process av separationsbaserad elektrisk laddning kallas elektrofores.

DNA-proverna, efter att ha smältats i fragment av olika storlekar med ett restriktionsenzym (endonukleas), sättes till bärarmedium, såsom agrosgel eller akrylamid. Gelens porer beror på sin procentandel och kan jämföras med en (molekylär) sikt. Således beror migrationshastigheten hos DNA-fragmenten genom gel på både DNA-fragmentstorlek och applicerad spänning.

Förfarandet för att separera och dra av specifikt DNA-fragment är Southern blotting. Betydelsen av denna teknik är att enkelsträngsfragmentet kan överföras genom kapillärverkan till ett fast bärarmedium (Nylon eller cellulosamembran) och permanent fixerad genom upphettning (Fig. 48.3).

Efter elektrofores kan DNA-mönstret visualiseras under UV-lampa efter behandling med etidiumbromidfärg; etidiumbromiden är ett fluorescerande färgämne. Agroselelektroforesen skiljer sig från 100 baspar till 60000 baspar (60 kb) medan polyakrylamidgeler effektivt separerar fragment än 1000 baspar (1 kb).

Pulslelektrofores (PFGE) har gjort det möjligt att separera DNA-fragment även upp till 2 kb. I detta förfarande ändras det elektriska fältet i olika riktningar och tvingar molekylerna av DNA att omriktas mellan varje puls eller elektrisk ström. Detta är den bästa tekniken för att identifiera en känd gen.

Endonukleaser kan känna igen 3, 4, 5, 6 eller 8 baspar och finns tillgängliga på marknaden.

PCR buffert / salter.

För Taq-DNA-polymeras tillverkas bufferten enligt nedan:

50 mM KCl

10 mM Tris-HCl vid rumstemperatur

Dimetylsulfoxid (DMSO) och glykol används som samlösningsmedel i PCR-buffertar när målet har mycket hög denatureringstemperatur.

Deoxynukleotidtrifosfat (dNTPs) är jonkoaktorer.

Nu tillhandahåller bioteknikföretag beredda lösningar.

Grundprincipen beskrivs enligt följande:

Det finns fyra dNTP, nämligen dATP (adenintrifosfat), dCTP (cytosin), dGTP (gunin), dUTP (uracil) som används enligt basparreglerna för att förlänga primern och i slutändan att kopiera målsekvensen.

DNTP binder med Mg ²⁺ . Mängden dNTP som är närvarande i en reaktion bestämmer mängden ledig Mg2 ⁺ tillgänglig för optimal enzymaktivitet. DNTP-lösningar bör neutraliseras med Tris-basen till pH 7, 0 och deras koncentration bör bestämmas spektrofotometriskt.

Substrat och substratanaloger:

Taq-polymeras fungerar (dNTP) mycket effektivt. Emellertid finns det några modifierade substrat som är tillgängliga i stället för Tag DNA-polymeras-substrat. De är dogoxigenin- dNTP, biotin-11-dUTP, C7deaza-dGTP och fluorescensmärkt dNTPS.

Följande typer av PCR används i allmänhet:

(1) Nested PCR;

(2) RT-PCR;

(3) Anchor PCR;

(4) Asymmetrisk PCR;

(5) Inverse PCR;

(6) DOP-PCR.