Nya framsteg i diagnostik av malaria

Nya framsteg i diagnostik av malaria - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Introduktion:

I Indien är malaria ett stort hälsoproblem; det har förekommit många utbrott i Rajasthan och nordöstra staterna. I Rajasthan förekomst P. falciparum ökar. I Delhi P. vivax är den vanligaste arten, men P. falciparum uppträder också. Malaria, ett världsomspännande problem, dödar mellan 1, 5 och 2, 7 miljoner människor varje år. Med andra ord dödar den en person (ofta ett barn <5 år) var 12: e sekund. Dessutom är 300-500 miljoner människor smittade med sjukdomen varje år.

För bekämpning av sjukdom är snabb och noggrann diagnos viktigast. Malariagnetik görs ofta endast på grundval av kliniska symtom, men dess noggrannhet är i bästa fall 50 procent. Nyare avancerade diagnostiska tekniker finns nu tillgängliga. Nyligen införda undersökningar baserade på immunanalys är snabba (<10 min / test) och minst lika känsliga som traditionell mikroskopi.

Ljusmikroskopi: Tjockt och tunt blodutslag:

Det traditionellt accepterade laboratorieförfarandet för diagnos av malaria har varit mikroskopisk undersökning Giemsa-eller Field-stained blood smears. Idealt sett bör blod erhållas med en fingerprik; blod erhållet genom venipunktur och antikoagulerat (EDTA eller heparin) är emellertid acceptabelt om det omedelbart undersöks. Både tjocka och smala utstrykningar bör göras. Tjock smet, koncentrerar röda blodkroppar 20 - 30 gånger på en liten yta, ökar känsligheten hos tekniken och är mycket bättre än tunna smuts. Tunn smet är dock mer specifikt.

Det är den accepterade guldstandarden för diagnos men är arbetsintensiv och tolkning av resultat kräver stor kompetens, särskilt med låg parasitemi. Dessutom kan P falciparum parasiter som ofta sekvestreras bort från perifert blod lätt missas.

Kvantificering av parasiter genom undersökning av blodutslag:

Det finns många metoder för att kvantifiera malarial parasiter i tjocka smuts. Parasitnivåer kan också kvantifieras genom undersökning av ett smalt blodsprut. En stor nackdel med tjocka smutsar är att det ofta kräver en viss kompetens som kan vara otillgänglig.

Teoretiskt bör undersökaren räkna ut tjockfält som innehåller 20 eller fler leukocyter / hpf. Faktum är att fält som innehåller 20 eller fler leukocyter är för tjocka att räkna, medan fält som är enklaste att läsa är de som innehåller endast fem eller sex leukocyter / hpf.

Före färgning ska undersökaren kunna läsa utskrift genom ett väl förberedt, tjockt blodutslag. Undersökning av tunna smutsar är endast en tiondel lika känslig som undersökning av tjocka smuts. Således, även om undersökning av blodutsläpp är acceptabelt som universell "guldstandard", är det faktiskt ingen enda standardmetod som används av alla utredare för kvantifiering av parasiter genom att räkna parasiter i tjocka utstrykningar.

Dessutom, under utbildad personal, begränsar avsaknaden av mikroskop användbarheten av blodprovskontroll i många endemiska områden. Erkännande av dessa begränsningar har utvecklats alternativa tekniker för diagnos av malaria.

Fluorescerande mikroskopi:

Tre fluorescerande tekniker håller lov för diagnos av malaria.

Dessa är:

(i) Den kvantitativa buffy-coat (OBC) -metoden som är tillgänglig som ett kommersiellt kit

(ii) Kawamoto Acridine Orange (AO) -processen och

(iii) bensotiokarboxypurin (BCP) -förfarande

Dessa tre tekniker är snabba och lätta att utföra; När det finns mer än 100 parasiter / μL uppvisar de känslighet och specificitet som motsvarar de som uppnåtts genom tjock smältundersökning.

Både OBC- och Kawamoto-metoder använder akridinorange (AO) som fluorokrom för att fläcka nukleinsyrorna av malariella parasiter i ett prov. BCP är också en fluorokrom, som fläckar nukleinsyror. AO är ospecifik och fläckar nukleinsyror från alla celltyper.

Följaktligen behöver undersökaren lära sig att skilja fluorescerande färgade parasiter från andra celler och cellulära skräp. Känslighet för AO-färgning med parasitnivåer på mindre än 100 parasiter / μl har varit 41, 7-93 procent.

Specificitet av AP-färgning för P. vivax och P. falciparum är 52 respektive 93 procent. BCP-metoden har en känslighet och specificitet på mer än 90 procent. Viktig begränsning av metoder baserade på AO och BCP är deras oförmåga att differentiera bland plasmodiumarter. AO är farligt och kräver speciella bortskaffningskrav.

OBC och BCP är mer krävande tekniskt än Kawamoto. Kawamoto och AO-metoder kräver särskild utrustning och tillbehör och är dyrare. Priset på ett fluorescensmikroskop kan vara en begränsande faktor för laboratorier som är intresserade av att använda dessa metoder.

Detektion av specifika nukleinsyrasekvenser:

Detektion av nukleinsyrasekvenser specifika för Plasmodium parasiter kan vara användbar. I PCR-baserade tekniker detekteras förstärkt målsekvens genom interna prober eller analyseras genom gelelektrofores. Stor fördel med att använda en PCR-baserad teknik är förmågan att upptäcka en "låg parasitemi. Infektioner med levande parasiter kan detekteras med 100 procent specificitet.

Sådana tekniker är dock dyra och arbetsintensiva, kräver omfattande teknisk expertis, involverar flera steg och kan inte användas för att särskilja mellan livskraftiga och icke-levande organismer.

PCR-hämmare som är naturligt förekommande i blodprover kan resultera i ett signifikant antal falsk-negativa resultat. Falskt positiva resultat, på grund av överföringen, har också spelats in.

PCR-baserade tekniker har använts för att skärma givare i ett område där malaria är endemisk. Känsligheten och specificiteten av PCR-baserade metoder, uppskattade med undersökning av blodutslag som "guldstandarden", är vardera 90 procent eller mer.

Dessutom kan ytterligare framsteg i PCR-tekniken snart möjliggöra att livskraftiga parasiter skiljer sig från icke-förmånliga. För närvarande är användbarheten av sådan teknik begränsad av behovet av dyr, specialiserad laboratorieutrustning, personal som är utbildad inom genetisk teknik och "renrum" -anläggningar och av höga kostnader för enzymer och primers som används.

Antigen Detektion:

Antikroppsdetekteringstest för malaria var begränsad i känslighet och deras förmåga att särskilja aktiv från tidigare infektioner. Den nya generationen, antigenupptagningstester kan upptäcka färre parasiter och att producera snabba resultat (10-15 min). De är kommersiellt tillgängliga kit, som inkluderar alla nödvändiga reagenser, och kräver inte omfattande träning eller utrustning.

Det finns två parasitantigener som används i de nya, snabba diagnostiska testerna, histidinrika proteiner 2 (HRP-2), som endast produceras av P. falciparum och parasitlaktat-dehydrogenas (pLDH) antigenen, som produceras av alla fyra plasmodium arter infekterande man. Båda antigenen utsöndras i blodet av alla oönskade stadium av parasiten; pLDH-antigenet produceras också av gametocyter.

De senaste antigenupptagningstesterna är snabba och enkla att utföra, och har detekteringsgränser som kan jämföras med de av högkvalitativ mikroskopi (dvs 100-200 parasiter / μL). När det finns mer än 60-100 parasiter / μL, är HRP- 2-baserade tester är mycket (> 90%) känsliga och (> 90%) specifika, jämförda med tjock smearmikroskopi.

För närvarande finns två sådana test kommersiellt tillgängliga, ParaSight F-testet och det IKT (immunokromatografiska) Malaria Pf-testet. Båda testen utförs på fingerpinnarprover och identifierar bara P. falciparum malaria.

De är baserade på monoklonala antikroppar mot HRP-2, vilka immobiliseras på nitrocellulosabandningar för att producera dipsticks eller kartongprov (ICT Pf Test). I varje test indikeras ett positivt resultat av utseende av en röd linje på testremsan, där de monoklonala antikropparna immobiliseras.

Båda testen innehåller också en inbyggd kontroll; en kontrolllinje måste visas för ett test som anses vara giltigt. Känsligheten och specificiteten hos ParaSight F-testet är 88 respektive 97 procent, jämförbara med PCR.

Även om HRP-2-baserade serologiska tester har tillåtit snabb diagnos av falciparummalaria har de begränsad användbarhet. Eftersom HRP-2 endast är närvarande i P. falciparum, är tester baserade på detektering av HRP-2 negativa med infektion orsakad av vivax, oval eller malaria.

Många fall av malaria som inte är falciparum kommer därför att vara misdiagnostiserad som malaria-negativ. En annan begränsning av HRP-2-baserade tester är att HRP-2 kvarstår i blod långt efter kliniska symptom har försvunnit och parasiterna tydligen rensas från värden.

Faktum är att HRP-2 har upptäckts i mumier. Test för detta antigen kan därför inte vara användbart för screening av individerna till de endemiska områdena, som kan ha långvarig parasitemi på låg nivå. Den möjliga orsaken till persistens av HRP-2-antigen är inte väl förstådd. det kan spegla närvaro av latenta, livskraftiga parasiter (möjligen ett resultat av behandlingssvikt) eller av lösliga antigen-antikroppskomplex.

Persistensen kan också bero på vilken typ av anti-malariell terapi som inrättats. HRP-2-signalen kan kvarstå i 19 dagar efter uppenbarligen effektiv kinin och doxycyklinbehandling. Också persistent HRP-2 antigenemi har observerats under och efter artemeterbehandling.

Andra begränsningar är specifikt relaterade till tekniska aspekter av HRP-2-systemet. Exempelvis kan monoklonal IgG som används i ParaSight F-systemet korsreagera med reumatoid faktor och orsaka ett falskt positivt svar.

ICT-Pf-testet använder en monoklonal IgM, som inte korsreagerar och det finns inga rapporter om falskt positiva reaktioner som uppträder vid detta test på grund av reumatoid faktor. IKT Pf-testet kräver dock lagring vid 4 ° C, vilket begränsar användbarheten under fältsituationer.

pLDH-baserade serologiska analyser:

De nyaste snabba serologiska testerna för diagnos av malaria baseras på detektering av pLDH. Precis som HRP-2-baserade analyser är dessa tester känsliga, specifika och lätta att utföra, med resultat som kan erhållas på mindre än 15 minuter.

De pLDH-baserade analyserna kan också skilja mellan P. falciparum och andra Plasmodium-arter och eftersom pLDH endast produceras av levande parasiter, är de också användbara vid övervakning av anti-malariell terapi. pLDH från P. falciparum differentieras från värd LDH (h-LDH) med 3-acetylpyridin adenindinukleotid (APAD), en analog av Nikotinamid Adenin-dinukleotid (NAD).

De pLDH-baserade analyserna är tillgängliga i två former, en halvkvantitativ, torr, mätsticka (OptiMAL); och en kvantitativ immun-enzymatisk infångningsanalys. OptiMAL-analysen använder två monoklonala antikroppar, en specifik för P. falciparum och den andra som känner igen alla 4 Plasmodia.

Blodprovet som testats (10 | j, l fingerpick, helblod eller fruset hemolysat) blandas med 3ojL, lyseringsbuffert innehållande konjugerad monoklonal antikropp. Denna blandning får suga i OptiMAL, peppstickan.

Efter 3 minuter tillsättes 100 | j, l-clearingsbuffert. Om P. falciparum är närvarande i blodprovet, utvecklas tre linjer (inklusive en på toppen av varje pinne som representerar den positiva kontrollen) på dipsticks.

Två linjer indikerar P. vivax, P. malariae eller ibland P. ovale. En nyformaterad OptiMAL-2-remsa har tre testlinjer och en positiv kontrolllinje, vilket medger att alla fyra Plasmodium-arterna kan identifieras.

Varje test anses endast oavsiktligt om kontrolllinjen utvecklas. De monoklonala antikropparna som användes i OptiMAL-testet har testats fullständigt för korsreaktivitet med LDH från leishmania, babesia och patogena bakterier eller svampar och inga bevis på sådan korsreaktivitet har hittats.

HRP-2 befanns fortsätta mycket efter perifer parasitemi hade rensats. Även om pLDH-nivån nära följer perifer parasitemi och föll till odetekterbara värden 3-5 dagar efter kinin och doxycyklinbehandling, sjönk nivåerna av HRP-2-antigen endast efter 19 dagar, väl efter att patienten är symptom och tydligen parasitfritt.

OptiMAL-analys bör därför vara ett värdefullt verktyg vid övervakning av anti-malarial terapi. Upplösning av parasitemi och clearance av pLDH verkar parallellt med varandra.

OptiMAL-analyser är mycket mångsidiga. OptiMAL-testet har en känslighet av 94-88 procent respektive specificiteten på 100 och 99 procent för P. vivax respektive P. falciparum jämfört med blodutslag.

Detta test kan användas som ett epidemiologiskt verktyg eftersom i områden där mer än en art av Plasmodium cirkulerar kan den användas för att identifiera Plasmodium-arterna som smittar patienter i varje by snabbt och låter folkhälsoarbetare leverera den mest lämpliga kemoterapin .

Slutsatser:

Under de senaste åren har ansträngningar för att ersätta den traditionella och tråkiga behandlingen av blodproppar (en metod som utvecklats för nästan 100 år sedan) lett till tekniker för detektering av malariala parasiter som ger känsligheter som motsvarar eller bättre än mikroskopi.

Även om PCR-baserade metoder antagligen är de mest känsliga, är de så kostsamma och behöver sådan specialutrustning och träning som de osannolikt inte kommer att användas för rutinmässig diagnos i de flesta utvecklingsländer.

De är särskilt användbara för studier av stamskillnader, mutationer och gener som är inblandade i läkemedelsresistens i parasiten och för att visa nivån av samband mellan stammar associerade med olika utbrott av malaria. Den mest lovande, nya malariadiagnostiken är de serologiska mätsticktesten.

Dessa test, inklusive ParaSight F, ICT Pf Test och OptiMAL, är enkla att använda, lätt att tolka och producera resultat i 15 minuter eller mindre. Dessa tester är nästan lika känsliga som mikroskopisk undersökning av blodutsläpp, men kräver inte högkvalificerad personal att utföra eller tolka resultat.

OptiMAL-testet har de extra fördelarna med att kunna detektera alla fyra Plaspiodium-arterna och följa läkemedelsbehandlingens effektivitet eftersom det mäter ett enzym som endast produceras av levande parasiter.

Även om mätstickprov har två uppenbara begränsningar, borde det heller inte förhindras att dessa tester erhåller utbredd acceptans. Den första begränsningen är känsligheten. De tre aktuella marknadsförda analyserna har sensitivitetströsklar på 50-100 parasiter / μ1. Känsligheten för prover med <50 parasiter / μl är konsekvent 50% -70%.

Denna känslighetsnivå kan inte vara mycket av ett problem för dem som lever permanent i endemiska områden, som ofta inte ges behandling, såvida de inte har mer än 500 parasiter / μL blod, men kan innebära ett problem vid diagnos av malaria hos de individer som är från icke-endemiska områden men lever, arbetar eller reser i endemiskt område.

Eftersom de allra flesta malariapatienter har nivåer av parasiter som är väl över 50 parasiter / μL, skulle få patienter dock missdiagnostiseras om mätsticktesterna användes rutinmässigt. Den andra begränsningen av sådana test, åtminstone för närvarande, är deras kostnad.

Världshälsoorganisationen anser att diagnostiska tester för malaria bör kosta mindre än US $ 0, 40 / prov för dem som är i endemiska områden för att dra nytta av dem. Om inte mätsticktesten produceras i massiva siffror är detta pris ouppnåligt och inte praktiskt för tillverkare att träffas.

De nuvarande kostnaderna för mätsticktesten beror på köparens plats och den beställda volymen. Till exempel kostar kostnaderna för ICT Pf-testen från 1, 30 USD / test i utvecklingsländer. Para 0Sight F-testerna säljer för 1, 20 USD / test. OptiMAL-stripen säljer för närvarande för US $ 3, 00 / test.