Oxidas test på bakterier för att ta reda på deras förmåga att oxidera reducerad cytokrom C

Läs den här artikeln för att lära dig om oxidasetestet på bakterier för att ta reda på deras förmåga att oxidera reducerad cytokrom C:

Princip:

Vissa bakterier har förmåga att oxidera "reducerad cytokrom C" närvarande i sina celler till "oxiderad cytokrom C", eftersom de kan producera enzymet "cytokromoxidas".

Den oxiderade cytokrom C producerar lila färg (Wurster's lila) med färgämnet N-tetrametyl-para-fenylendiamin (dvs oxidasreagens).

I oxidasprovet överskrids näringsagaragarplattor som innehåller kolonierna i testbakterierna med lösningen av oxidasreagens. Om bakterierna har förmågan att producera enzymet cytokromoxidas, ändras koloniernas färg på plattorna till lila. Om bakterierna inte har förmåga att producera cytokromoxidas, behåller kolonierna den ursprungliga rosa färgen av oxidasreagenset.

Material som krävs:

Petriskålar, konisk kolv, bomullspropar, inokuleringsslinga av platina tråd, autoklav, bunsenbrännare, laminarkammare, kassettkärl, inkubator, Whatman filterpappersremsa, oxidasreagens (N-tetrametyl-para-fenylendiamin) näringsagar, isolerade kolonier eller rena kulturer av bakterier.

Procedur:

(a) plåtmetod:

1. Två petriskålar städas, täckas med hantverkspapper och binds med tråd eller gummiband (Figur 7.19). Dessa steg såväl som steriliseringen av petriskålarna i steg 6 utelämnas om ugnssteriliserade petriskålar används direkt.

2. Beståndsdelarna i näringsagaragar eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk kolv genom skakning och virvling.

3. pH-värdet bestäms med pH-papper eller pH-mätare och justeras till 7, 0 med 0, 1 N HCI om det är mer eller med användning av 0, 1 N NaOH om det är mindre.

4. Kolven upphettas för att upplösa agar i mediet fullständigt.

5. Kolven är bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

6. De två petriskålarna och den koniska kolven innehållande näringsagar agar steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter i en autoklav.

7. Efter sterilisering avlägsnas de från autoklaven och får svalna under en tid utan att mediet solidiseras. Kylning av mediet förhindrar kondens och ackumulering av vattendroppar inuti plattorna. Om mediet redan har beretts och stelnat under lagring, måste det vara flytande genom att värma försiktigt tills det smälter fullständigt.

8. För att bereda näringsagaragar, innan det steriliserade näringsämnet agarmediet kyles och stelnar i varmt smält tillstånd, hälls det aseptiskt, företrädesvis inuti en laminär strömningskammare, i de två steriliserade petriskålarna (ca 20 ml vardera), så att Det smälta mediet täcker helt ned petriskålen.

Därefter täcks plattorna med sina lock och får svalna för att stelna mediet i dem. Vattendamp som kan kondensera på plattans och lockens inre yta avdunstas genom att hålla plattorna och locken i inverterad position i en inkubator vid 37 ° C under ca 1 timme.

9. Varje platta är märkt på undersidan till fyra fjärdedelar.

10. "Spot-inokulering" av testbakterierna görs aseptiskt, företrädesvis i en laminärflödeskammare, i mitten av varje kvart genom att göra en fläck (eller smet) av bakterierna med hjälp av en flamsteriliserad slinga. Slingan steriliseras efter varje ympning.

11. De inokulerade plattorna inkuberas i inverterad position, upptill, vid 37 ° C i 24 timmar i en inkubator tills kolonierna hos bakterierna är synliga.

12. Plattorna är översvämmade med oxidasreagens.

(b) pappersmetod:

1. En Whatman filterpappersremsa, doppad i 1% oxidasreagens torkas och hålls i mörker.

2. Före användning är det fuktat och en slinga av testbakterierna läggs på den som en fläck med hjälp av en platinatrådsling. Nichrome-slingan kan oxidera reagenset. Därför måste platina slinga användas.

3. Platsen observeras efter 10 sekunder.

observationer:

(a) plåtmetod:

1. Lila färg utvecklas på kolonier av bakterier: Oxidas positiv.

2. Lila färg utvecklas inte på kolonier

(Rosa färg av oxidasreagenset behålls): Oxidas-negativ.

(b) pappersmetod:

1. Lila färg utvecklas på plats: Oxidas positiv.

2. Lila färg utvecklas inte på plats: Oxidas negativ.