Experiment för att isolera kolifag av ett virus (med diagram)

Experiment för att isolera koliphag av ett virus!

Princip:

Bakteriofagen eller faget (viruset) som infekterar bakterierna, Escherichia coli kallas colifag (coli: E. coli, fag: bakteriofag).

Det kan erhållas från en mängd olika naturliga källor, såsom jord, fekal material och råavlopp. Dess isolering från dessa källor är inte särskilt lätt, eftersom den är närvarande i låg koncentration.

Därför ökas först sitt antal med ett anrikningssteg, i vilket en rik kultur av värdbakterierna (dvs E. coli) sättes till det kolifaginnehållande provet och inkuberas. Kolifag infekterar E. coli och ökar i antal kraftigt. Denna kolifagrika kulturen centrifugeras för att sedimentera den partikelformiga substansen.

Sedimentet kasseras och supernatanten filtreras genom mikrobiellt filter för att behålla bakterier och andra partiklar, samtidigt som koliphagen passerar genom. Filtratet, rik på kolifag, används för att fröa en suspension av E. coli, som sedan får växa som en sammanflödig gräsmatta på en agarplatta.

Coliphagen växer inom E. coli-cellerna och lyser dem. Lysis av bakteriecellerna resulterar i bildandet av klara zoner på bakteriens sammanflyttande gräsmatta. Dessa klara zoner kallas plack. Varje klar zon antas bildas av en enda kolifag.

Material som krävs:

Pipetter, koniska kolvar, petriskålar, provrör, bomullsproppar, bunsenbrännare, kassera burk, centrifug, membranfiltreringsapparat, laminärflödeskammare, autoklav, inkubator, bakteriofagbuljong, tryptonmjuk agar, tryptonhård agar, näringsbuljongkultur av bakterier Escherichia coli (t.ex. E. coli B), prov (t.ex. rå avloppsvatten).

Procedur:

1. Fem pipetter (i rostfritt stålpipettväska) och fem petriskålar steriliseras i en varmluftsugn vid 180 ° C i 3 timmar. Alternativt kan de täckas med hantverkspapper, bundet med tråd eller gummiband och steriliseras i en autoklav tillsammans med mediet (Figur 8.5).

2. Beståndsdelarna i bakteriofagbuljongmedium eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs, löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk flaska och pH justeras till 7, 6. Kolven är bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

3. Beståndsdelarna i tryptonmjuk agarmedium eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs, löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk kolv och pH justeras till 7, 5.

4. Detta flytande medium fördelas i 5 provrör (2 ml vardera), bomullspluggat, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

5. Beståndsdelarna i tryptonhårigt agarmedium eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk flaska genom upphettning efter pH-justering till 7, 5. Kolven är bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

6. Kolven innehållande bakteriofagbuljong, de 5 tryptonmjuka agarrören, kolven innehållande tryptonhård agarmedium och en tom bomullspluggad 250 ml konisk flaska steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter i en autoklav.

7. Det steriliserade tryptonhåriga agarmediet i den koniska kolven hälls i 5 steriliserade petriskålar aseptiskt och får svalna för att få 5 tryptonhåriga agarplattor.

8. I den bomullspluggade, steriliserade, tomma 250 ml koniska kolven, 5 ml steriliserad bakteriofagbuljong, 5 ml E. coli B-buljongkultur och 45 ml rå avlopp överförs aseptiskt, företrädesvis i en laminärflödeskammare (figur 8.6) .

9. Kolven inkuberas vid 37 ° C i 24 timmar för att tillåta att kolifag i avloppsvattnet prolifererar i värdens bakterieceller (celler av E. coli B).

10. Innehållet i kolven hälles i 100 ml centrifugrör och centrifugeras vid 2500 rpm i 20 minuter i en centrifug för att sedimentera partiklarna. Sedimentet kasseras.

11. Supernatanten, rik på kolifag, filtreras genom en membranfiltreringsapparat. Återstoden kasseras.

12. De fem steriliserade trypton-mjuka agarrören tas och upphettas på ett vattenbad till 100 ° C för att smälta agar. Rören kyles och hålls vid 45 ° C på ett vattenbad.

13. Med hjälp av en steril pipett överföres 1, 2, 3, 4 och 5 droppar av det bakteriefria filtratet, som är rik på kolifag, aseptiskt till de fem trypton-mjuka agarrören.

14. På varje tryptonmjuk agarrör överförs 0, 1 ml av en näringsbuljongkultur av Escherichia coli B aseptiskt.

15. Innehållet i de fem tryptonmjuka agarrören som har viruset, kolifagen och bakterierna, E. coli B blandas snabbt genom att rotera rören mellan handflatorna.

16. Innehållet hälls över de fem tryptonhåriga agarplattorna (märkta 1 till 5 droppar), varigenom bildas ett dubbelskiktsklädeskulturpreparat. Plattorna svängs försiktigt och får härdas.

17. De inokulerade plattorna inkuberas i ett inverterat läge vid 37 ° C i 24 timmar i en inkubator.

observationer:

1. Alla plattor observeras för plackbildande enheter (PFU) som utvecklas som klara zoner på bakterieplattor. Plackbildning är en indikation på närvaron av kolifag i odlingen.

2. Varje plack representerar en rik tillväxt av isolerat kolifag.

3. Antalet plack räknas i alla tallrikar och tabelleras enligt följande (tabell 8.1).

Tabell 8.1: Observationer av antalet kolifag :