Experiment till odling och uppräkning av bakteriefag
Experimentera med att odla och räkna upp en bakteriefag!
Princip:
En suspension av bakterier som är mottaglig för bakteriofag (virus som infekterar bakterier) utsädes med den bakteriofagen och får växa som en sammanflödig gräsmatta på en agarplatta.
Bakteriofagpartiklarna växer inom bakteriecellerna och lyser dem. Lysis av bakteriecellerna resulterar i bildandet av klara zoner i bakteriens sammanflyttande gräsmatta. Dessa tydliga zoner kallas "plack". Varje klar zon antas bildas av en enda bakteriofagpartikel. Antalet plackbildande enheter (PFU) representerar således antalet bakteriofager.
Seriell utspädningsteknik används vid uppräkning av bakteriofager som liknar den som används vid uppräkning av bakterier. Antalet fagpartiklar som ingår i ett prov bestäms genom att räkna antalet plack som bildas på den utsäde agarplattan och multiplicera detta med utspädningsfaktorn.
För att bestämma ett giltigt fagantal bör antalet plack per platta inte överstiga 300 eller vara mindre än 30. Plattor som visar mer än 300 PFUs benämns "för många att räkna" (TNTC), medan plattor som visar färre än 30 PFUs benämns "för få att räkna" (TFTC).
Material som krävs:
Tryptonbuljong, tryptonmjuk agar, tryptonhårig agar, konisk kolv, provrör, steriliserade petriskålar, bomullsproppar, stamkultur av bakteriofag (Ex: T 2 coliphage), näringsbuljongkultur av bakterierna (ex: Escherichia coli B), steriliserade pipetter, autoklav, varmvattenbad, bunsenbrännare, laminärflödeskammare, kassera burk, inkubator.
Procedur:
1. Femton pipetter (i rostfritt stålpipettväska) och fem petriskålar steriliseras i en varmluftsugn vid 180 ° C i 3 timmar. Alternativt kan de täckas med hantverkspapper, bundet med tråd eller gummiband och steriliseras i en autoklav tillsammans med mediet (Figur 8.3).
2. Beståndsdelarna i tryptonbuljongmedium eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml buljongen vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk kolv genom skakning och virvling. Dess pH justeras till 7, 5 med användning av 0, 1 N HCl eller 0, 1 N NaOH efter behov. Kolven värms upp, om så krävs, för att lösa upp ingredienserna fullständigt.
3. Buljongen fördelas i 10 provrör (9 ml vardera), bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.
4. Beståndsdelarna i tryptonmjuk agarmedium eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk kolv genom skakning och virvling. Dess pH justeras till 7, 5 med användning av 0, 1 N HCl eller 0, 1 N NaOH efter behov. Kolven upphettas för att upplösa agar i mediet fullständigt.
5. Detta flytande medium fördelas i 5 provrör (2 ml vardera), bomullspluggat, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.
6. Beståndsdelarna i tryptonhårigt agarmedium eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml av mediet vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk flaska genom upphettning efter pH-justering till 7, 5. Kolven är bomullstoppad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.
7. De 10 tryptonbuljongörerna, de 5 tryptonmjuka agarrören och det kolvhaltiga tryptonhåriga agarmediet steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter i en autoklav.
8. Det steriliserade tryptonhåriga agarmediet i den koniska kolven hälls i 5 steriliserade petriskålar aseptiskt för att få 5 tryptonhåriga agarplattor.
9. En ml av stamkulturen hos bakteriofagen (Ex: T2-kolifag) överföres aseptiskt, företrädesvis i en laminär strömningskammare, till ett tryptonbuljongrör (9 ml) med användning av en steriliserad pipett. Detta blir 10 gånger utspädningen (dvs 10 -1 ). Detta späds aseptiskt i de andra nio buljongörerna, så att en slutlig utspädning blir 10-10 (figur 8.4).
10. De 5 steriliserade tryptonmjuka agarrören tas och upphettas på ett vattenbad till 100 ° C för att smälta agar. Rören kyles och de smälta, mjuka, mjuka rören hålls vid 45 ° C.
11. Bland de ovanstående 10 rören innehållande fag i olika koncentrationer väljs fem rör (dvs 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10-8 och 10-9 ). Från dessa rör överförs aseptiskt 1 ml vardera till de fem tryptonmjuka agarrören med användning av separata steriliserade pipetter.
12. Två droppar näringsbuljongkultur av bakterierna (Ex: Escherichia coli B) överföres aseptiskt, företrädesvis i en laminär strömningskammare, till varje tryptonmjuk agarrör innehållande bakteriofagen vid fem olika koncentrationer (10-5 till 10-9 ).
13. Innehållet i de fem tryptonmjuka agarrören innehållande bakteriofagen och bakterierna blandas snabbt genom att rotera mellan handflatorna.
14. Innehållet hälls aseptiskt över de fem trypton-hårda agarplattorna märkta 10-5 till 10 -9, varigenom bildas en dubbelskiktsklädeskulturpreparat. Plattorna svängs försiktigt och får härdas.
15. Plattorna inkuberas i omvänd position vid 37 ° C i en inkubator.
observationer:
1. Alla plattor observeras för plackbildande enheter (PFU) som utvecklas som klara zoner på bakterieplattor.
2. Endast de plattor som har PFU mellan 30 och 300 anses för uppräkning av fag. Antalet PFU på varje platta räknas. Plattor som visar mer än 300 PFU är betecknade "för många att räkna" (TNTC), medan plattor som visar färre än 30 PFU är betecknade "för få att räkna" (TFTC). Sådana plattor beaktas inte.
3. Baserat på observationerna beräknas antalet bakteriofager per ml av stamfagkulturen med användning av följande formel.
Antal fag / ml = Antal PFU X-spädningsfaktor
Om exempelvis PFU: s antal är 280 i en utspädning av 10-7, är antalet fag i lagerkulturen av fag 280 X 10 7 fag / ml (= 2, 80 X 10 9 fag / ml).
