I dole-testet för att finna ut en bakteries förmåga att hydrolysera aminosyran tryptofan (med figur)

I Dole-testet för att hitta en bakteries förmåga att hydrolysera aminosyran tryptofan!

Princip:

Vissa bakterier har förmågan att hydrolysera aminosyran tryptofan till indol, eftersom de kan producera enzymet "tryptofanas".

Tryptofan hydrolyseras med produktionen av indol, pyruvsyra och ammoniak. Indol detekteras av färgreagenset, paradimetylaminobensaldehyd (p-DMAB, dvs Kovacs reagens), vilket ger en rosa ring. Indol reagerar med p-DMAB för att producera föreningen 'quinoidal rödviolett förening (rosindolfärgämne)', som är rosa i färg. Ringen produceras vid ytan, då reagenset framställes i amylalkohol.

I indolprovet odlas testbakterierna i en buljongmedium som innehåller tryptofan. Om bakterierna har förmåga att hydrolysera tryptofan till indol bildas en rosa ring vid ytan av buljongkulturen vid tillsats av p-DMAB.

Material som krävs:

Provrör, konisk kolv, bomullsproppar, inokuleringsslinga, autoklav, bunsenbrännare, laminärflödeskammare, kassera burk, inkubator, tryptonbuljong, Kovacs reagens (paradimetylaminobensaldehyd), isolerade kolonier eller rena kulturer av bakterier.

Procedur:

1. Ingredienserna av tryptonbuljongmedium eller dess färdiga pulver som krävs för 100 ml buljongen vägs och löses i 100 ml destillerat vatten i en 250 ml konisk kolv genom skakning och virvling. Trypton fungerar som en källa till tryptofan. Därför är tillsats av tryptofan till buljongen valfri (Figur 7.3).

2. pH-värdet bestäms med pH-papper eller pH-mätare och justeras till 7, 5 med 0, 1 N HC1 om det är mer eller använder 0, 1N NaOH om det är mindre. Kolven värms upp, om så krävs, för att lösa upp ingredienserna fullständigt.

3. Buljongen fördelas i fem provrör (ca 5 ml vardera), bomullspluggad, täckt med hantverkspapper och bundet med tråd eller gummiband.

4. Buljongörerna steriliseras vid 121 ° C (15 psi tryck) i 15 minuter i en autoklav.

5. Buljongörerna får svalna till rumstemperatur.

6. Testbakterierna ympas aseptiskt, företrädesvis i en laminär strömningskammare, in i buljongen med hjälp av en inokuleringsslinga som steriliseras över bunsenflamma. Slingan steriliseras efter varje ympning.

7. De inokulerade buljongörerna inkuberas vid 37 ° C i 48 timmar i en inkubator.

8. Färgreagenset, para-dimetylaminobensaldehyd (p-DMAB), (dvs. Kovacs reagens) tappas i buljongörerna (0, 5 ml vardera) och observeras efter 1 minut.

Alternativt:

7. Pappersremsor som blötläggs i oxalsyra sätts i munnen av de inokulerade buljongörerna så att ungefär hälften av pappersremsorna förblir inuti rören utan att beröra buljongen och den andra halvan förblir till utsidan. Därför skärs filterpapper i remsor av ca 35 mm lång och 5 mm bred. Remsorna blötläggs i varm mättad vattenhaltig lösning av oxalsyra och torkas före användning.

8. De inokulerade buljongörerna inkuberas vid 37 ° C i 48 timmar i en inkubator.