Agrobacterium-medierad genöverföring i växter | Bioteknik (med diagram)

Agrobacterium-medierad genöverföring i växter!

Agrobacterium är en gram-negativ patogen bakterie som är involverad i att orsaka krongallsbildnings sjukdom hos växtarter. Krongallbildningen beror på överföringen av ett segment av onkogen (cancerframkallande) DNA i växtcellen vid sårade platser.

Detta DNA-segment (överförings-DNA eller T-DNA) är närvarande på stor plasmid som kallas Tumor-inducerande (Ti) plasmider i bakterien. T-DNA (ca 20 kb lång) integreras i växtkromosomen genom rekombination. En serie virulens (vir) gener är inblandade i att styra infektionsprocessen. Så när en växtrot eller en stam såras ger den av sig ett visst svar.

Som svar på dessa signaler aktiveras virgenerna av A. tumefaktioner och styr en serie händelser som krävs för överföringen av T-DNA från Ti-plasmiden till växtens kromosom. Funktionen av olika vir gener innefattar en kopia av T-DNA, följt av bindning av en produkt till den kopierade T-DNA-strängen för att fungera som en ledare, tillsätt därefter proteiner tillsammans med längden av T-DNA, möjligen som en skyddande mekanism.

Dessa öppnar så småningom en kanal i bakteriemembranet, genom vilket T-DNA passerar. T-DNA kommer sedan in i växten genom såret. Det är emellertid fortfarande inte klart hur det bakteriella DNA rör sig från cytoplasman till växtcellens kärna eller hur T-DNA integreras i växtkromosomerna.

För att använda dessa bakterier som en vektor avlägsnas dess T-DNA-region med undantag av gränsområdena och virgenerna. Transgen införs sedan mellan T-DNA-regionerna, där den överförs till växtcell och integreras i växtens kromosom (Fig 1). T-DNA klonas i Ti-plasmider, vilka skärs i storlek och replikeras i E. coli för att underlätta ytterligare manipulering. Dessa vektorer mobiliseras till Agrobacterium värdstammar och användes för att infektera växtvävnaderna.

Dessa infekterade växtvävnader odlas därefter på media innehållande specifika kemikalier, tillväxtregulatorer för att underlätta regenerering av transformerade celler. Valet av transformanter utförs i närvaro av ett antibiotikum närvarande i odlingsmediet. De transformerade växterna analyseras så småningom för stabil integration och funktionell analys av den insatta genen.

Protoplastfusion:

Celler utan cellväggen kallas protoplaster. Dessa protoplaster kan uppta DNA direkt i närvaro av vissa kemikalier (som polyetylenglykol, PEG). Högre koncentration av PEG orsakar permeabilisering av plasmamembran, vilket möjliggör upptag av DNA i protoplaster. Även elektriska signaler kan användas för att skapa små hål i plasmamembran genom att passera en elektrisk ström.

Detta är känt som elektroporation. Dessa små öppningar hjälper sedan till utländska DNA-upptag genom protoplaster. Detta följs därefter av cellväggbildning och initiering av celldelning. Produktionen av transgena växter genom direktgenöverföring till protoplaster beror dock på ett effektivt protoplastsystem till växtregenerering.

Gene-gun eller Biolistic Gene Transfer:

Det här är den senaste tekniken där man kan leverera DNA av intresse till en cell genom att ladda mikropartiklar (som guld eller volfram) med hög hastighet. Denna process för att leverera DNA kallas bombardemang. Inuti cellen frisätts DNA-molekyler från partiklarna och så småningom blir detta DNA integrerat i värdcellens kärn- eller organelgenom.

Vävnadsexplanterna odlas så småningom på media som innehåller specifika hormoner / antibiotika för att välja de transformerade plantorna. När genen av intresse överförs till den önskade värden, måste dess stabila integration etableras som görs genom regenererande växter. Detta uppnås genom vävnadsodlingstekniken.

Processen av vävnadsodling kan i stor utsträckning delas in i fyra steg:

Steg I:

Inkluderar urvalet av lämpliga eksplantat och dess överföring till näringsmedium.

Steg II:

Innehåller proliferation av växande vävnad på multiplikationsmediet.

Steg III:

Innehåller överföring av växande vävnad (callus) till media där den kan skilja sig åt i olika delar.

Steg IV:

Inkluderar överföring av plantor till den naturliga miljön. Intressanta gener kan dock läggas på två sätt som känsla och antisensorientering. För att uttrycka eller överge uttrycket genen kan man sätta genen i sansorientering. Om man vill blockera den oönskade produkten eller ett steg i en biokemisk väg kan man dock sätta genen i en antisensorientering.